產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品貨號(hào)：
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產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
Ex/Em (nm) |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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T6178S |
YF®488 TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒 （綠色，細(xì)胞樣本） |
490/515 |
20 T |
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T6178L |
50 T |
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T6179S |
YF®594 TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒 （紅色，細(xì)胞樣本） |
590/617 |
20 T |
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T6179L |
50 T |
產(chǎn)品規(guī)格：
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規(guī)格 組分 |
20 T |
50 T |
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A.YF®488/594 TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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B. TdT Enzyme |
20 μL |
50 μL |
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C. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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D. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
儲(chǔ)存條件：-20℃保存，組分A需避光，避免反復(fù)凍融。有效期見外包裝。冰袋運(yùn)輸。
應(yīng)用范圍：細(xì)胞凋亡檢測。
產(chǎn)品介紹
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí), 會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與YF® -dUTP結(jié)合，從而通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中廣泛采用。
本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，耗時(shí)短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測。
注意事項(xiàng)
1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時(shí)可適當(dāng)減少染色時(shí)間。
3. 實(shí)驗(yàn)時(shí)建議增加陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組。
4. 組分A使用時(shí)請(qǐng)佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請(qǐng)立即用大量水沖洗。
5. 熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
7. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
常見問題解答：
1. 為什么出現(xiàn)了一些非特異標(biāo)記？
1)有些細(xì)胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議:取出細(xì)胞后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。
2) 固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致中心部分細(xì)胞固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議:推薦使用4%多聚甲醛。
3) TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞表面不能保持濕潤。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT 酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
4) 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色。
2. 為什么沒有染上熒光？
1) 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率。
2) 細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，不同的細(xì)胞所需要的通透時(shí)間略有不同，適當(dāng)調(diào)整。
3) 延長標(biāo)記時(shí)間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量。
4) 確定實(shí)驗(yàn)對(duì)象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對(duì)照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。
3 如何對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染？
可在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。
4. 為什么熒光背景高？
1) 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗(yàn)證。
2) TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用。
3) 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4) 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色。
5) DAB 孵育時(shí)間過長，減少DAB 染色時(shí)間。
6) Biotin-X-dUTP 的非特異性結(jié)合，在TdT 酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
5. 標(biāo)記率低？
1) 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2) 固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時(shí)間。
3) 貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會(huì)細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，可以對(duì)多孔板進(jìn)行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機(jī)，請(qǐng)注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)被洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。
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