產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品介紹
APC-Annexin V和PI凋亡試劑盒提供了一種通過標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（綠色）和壞死或晚期凋亡的細(xì)胞（紅色）快速簡便地檢測細(xì)胞凋亡水平的方法。Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與磷脂酰絲氨酸(PS)選擇性結(jié)合。磷脂酰絲氨酸(PS)主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞質(zhì)相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，此時，使用遠(yuǎn)紅外熒光蛋白APC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-APC，與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，就可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡直接檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種DNA結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。PI可以由488、532或546 nm的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。
應(yīng)用范圍
細(xì)胞凋亡檢測
產(chǎn)品貨號
A6030S/A6030M/A6030L
儲運(yùn)條件
4℃避光冷藏，有效期見外包裝；冰袋運(yùn)輸。
產(chǎn)品組分
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組分 |
A6030S (10 T) |
A6030M (50 T) |
A6030L (100 T) |
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1×Annexin V結(jié)合緩沖液 |
10 mL |
50 mL |
2×50 mL |
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Annexin V-APC |
50 μL |
250 μL |
500 μL |
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PI |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
注：B組分請勿凍存。
產(chǎn)品參數(shù)
Annexin V-APC: Ex/Em = 650/660 nm
PI: Ex/Em=535 nm/617 nm (with DNA)
注意事項(xiàng)
1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 為降低細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至30 min。
3. 由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1 h之內(nèi)進(jìn)行分析。
4. 為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。
5. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品和藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
7. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作
常見問題解答：
◆為何染色結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率過高？
1. 凋亡時間處理過長，使細(xì)胞全部死亡。建議重新摸索細(xì)胞凋亡條件，使細(xì)胞處于不同的凋亡狀態(tài)。
2. 對于貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化時間過長或機(jī)械刮擦細(xì)胞會暫時破壞質(zhì)膜，使Annexin V能夠與細(xì)胞膜胞內(nèi)面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，導(dǎo)致假陽性染色。建議在胰蛋白酶消化或機(jī)械刮擦細(xì)胞后，讓細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30分鐘，以恢復(fù)其膜完整性。
◆實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用什么儀器觀察？
實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，但更推薦使用流式細(xì)胞儀。因?yàn)檎５募?xì)胞和凋亡的細(xì)胞膜上都有磷脂酰絲氨酸（PS），只是凋亡細(xì)胞膜外更多，可以結(jié)合更多的Annexin V，流式細(xì)胞儀更靈敏，可以區(qū)分出微小差異，將正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞分成不同的兩群，但如果用熒光顯微鏡，可能觀察不到這一差別，尤其是貼壁細(xì)胞。若要在成像測定中檢測細(xì)胞凋亡，推薦使用SuperView? 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。
◆流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果圖中的各個象限代表什么狀態(tài)的細(xì)胞？
左上角：Annexin V-/PI+，機(jī)械損傷細(xì)胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡細(xì)胞或壞死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡細(xì)胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常細(xì)胞。
◆這款試劑盒可同時檢測出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測細(xì)胞凋亡時PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測細(xì)胞周期時需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測出來的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時，凋亡檢測與周期檢測時PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 如果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆各象限代表的細(xì)胞狀態(tài)問題？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。
◆假陽性問題？
1. 消化液中含有EDTA或消化時間過長引起的假陽性。Annexin V和PS的結(jié)合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會造成假陰性。其次消化時間不宜過長，吹打細(xì)胞要輕柔，因?yàn)橐让傅倪^度消化和機(jī)械損傷都會引起細(xì)胞膜的損傷，造成假陽性。細(xì)胞消化下來后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育30min，使細(xì)胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽性，或者將細(xì)胞報訊在含2% BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。2. 如果樣品來源于血液，必須去除血液中的血小板，因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議：可以含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板， 最后細(xì)胞多洗幾遍，減小EDTA螯合鈣離子產(chǎn)生的影響。
3. 神經(jīng)細(xì)胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細(xì)胞凋亡不適用于神經(jīng)細(xì)胞。
4. 誘導(dǎo)時間過長。一般情況下誘導(dǎo)幾個小時就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時以上，誘導(dǎo)時間過長會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差，假陽性結(jié)果偏高。
◆熒光染料選擇的問題？
1. 實(shí)驗(yàn)樣本是否帶熒光，因?yàn)楦腥静《净蛸|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往帶GFP熒光，GFP與YF488/FITC通道重疊，不能選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V，此時如果只有488 nm一根激光管可以用PE標(biāo)記Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式細(xì)胞儀帶有488 nm和633 nm兩個或以上激光管，首先考慮用APC或YF647標(biāo)記 Annexin V，因?yàn)樗蚉I通道幾乎不用考慮光重疊問題，可以減少調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒?，如果只?88 nm激光管則可選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V。
3. 處理因素是否帶有熒光，本實(shí)驗(yàn)室就碰到過一個促凋亡藥物Doxorubicin本身發(fā)紅色熒光，對PI通道的檢測造成嚴(yán)重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時建議選用A6079或Y6102 。
◆圈門問題？
1.要特別注意在FSC/SSC圈門時，所選細(xì)胞范圍會對結(jié)果造成較大影響，所以在分析數(shù)據(jù)時，要把所有細(xì)胞都圈進(jìn)FSC/SSC的門內(nèi)，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會更可信。如圖，使細(xì)胞群大概位于對角線上，并且細(xì)胞群較集中，群內(nèi)細(xì)胞比例要在80%以上，如果細(xì)胞全部圈入，細(xì)胞比例才50%或者更低，說明細(xì)胞被壓在了坐標(biāo)軸上，這時要重新調(diào)節(jié)FSC和SSC。
2.貼壁細(xì)胞做Annexin V凋亡檢測，通常分群不太規(guī)則，這時我們可以根據(jù)不加藥細(xì)胞來畫不規(guī)則的十字門。如上面圖形的設(shè)門方式：
◆免疫染色與凋亡染色順序問題?
Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？可以，但建議Annexin V和其它抗體分開染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時標(biāo)記淋巴細(xì)胞，可以先在PBS中標(biāo)記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標(biāo)記Annexin V。
◆這款試劑盒可同時檢測出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測細(xì)胞凋亡時PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測細(xì)胞周期時需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測出來的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時，凋亡檢測與周期檢測時PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 若果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆固定、冷凍、切片或解離的組織，還可以做流式細(xì)胞分析嗎？
不建議做流式細(xì)胞分析。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個，活性好，這些狀態(tài)下的樣本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影響，因此無法依賴膜的完整性區(qū)分健康細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。組織在凍存、復(fù)溫的過程中會有大量的細(xì)胞死亡，同時經(jīng)過這一過程的組織在分離成單個細(xì)胞的時候會形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測，所以用于流式檢測的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測，效果最好。 液氮保存的◆組織塊，可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。
◆Annexin V可以用在植物和細(xì)菌中嗎？
Annexin V也可以用在植物和細(xì)菌中檢測凋亡，具體實(shí)驗(yàn)步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)。
使用本產(chǎn)品的文獻(xiàn)：
參考文獻(xiàn)
1.Terminating the criminal collaboration in pancreatic cancer: Nanoparticle-based synergistic therapy for overcoming fibroblast-induced drug resistance.
應(yīng)用方向：檢測胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞的凋亡
2.Ribosomal protein L23 negatively regulates cellular apoptosis via the RPL23/Miz-1/c-Myc circuit in higher-risk myelodysplastic syndrome.
應(yīng)用方向：檢測高危骨髓增生異常綜合征（MDS）患者CD34+細(xì)胞的凋亡
3.Chlamydia trachomatis plasmid-encoded protein Pgp3 inhibits apoptosis via the PI3K-AKT-mediated MDM2-p53 axis.
應(yīng)用方向：檢測Hela細(xì)胞的凋亡
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